作业帮HRP（辣根过氧化物酶）标记抗体的原理及操作流程是什么 具体怎么弄
来源：学生作业帮 编辑：拍题作业网作业帮 分类：生物作业 时间：2024/06/02 14:20:00
HRP（辣根过氧化物酶）标记抗体的原理及操作流程是什么 具体怎么弄
主要怎么操作 每步原理是什么 望告知
主要怎么操作 每步原理是什么 望告知
HRP标记抗体的方法
酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法.对于制备HRP结合物,可用戊二醛二步法和过碘酸钠法.尤以简易过碘酸钠法更为常用.戊二醛二步法
1.原理
戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物.
2.标记步骤
(1) 称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中,于室温静置过夜.(2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱,用生理盐水洗脱.流速控制在1ml／1分钟,收集棕色流出液.如体积大于5ml,则以PEG浓缩至5ml.放置25ml小烧杯中,缓慢搅拌.(3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中.(4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml,继续搅拌3?小时.(5) 加0.2M赖氨酸0.25ml,混匀后,置室温2小时.(6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时.(7) 3000rpm离心半小时,弃上清.沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中.(8) 将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存.
3.结果判定
(1) 定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验.然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定其活性.最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择).(2) 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm).酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4 IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62 酶量(mg／ml) IgG量(mg／ml) 酶量 克分子比值＝———————— ÷ ——————— ＝ ——— × 4 40,000 160,000 IgG量 (3) 本法标记步骤比较简单,重复性好.缺点是酶的利用率低,一般只有2～4％的酶与蛋白质结合.
4.试剂及器材
(1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml,0.2M NaH2PO4 51ml,NaCl1.8克,加蒸馏水至200ml.(2) 1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合.(3) 1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合.(4) 0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中.(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理盐水.(6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液.(7) 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG,MW2000).(8) 纯化的特异性抗体或抗Ig抗体.(9) HRP(RZ>3.0).(10) Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm).(11) 搅拌器,分光光度计,离心机.(12) 透析袋,大、小烧杯,试管,吸管等.
酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法.对于制备HRP结合物,可用戊二醛二步法和过碘酸钠法.尤以简易过碘酸钠法更为常用.戊二醛二步法
1.原理
戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物.
2.标记步骤
(1) 称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中,于室温静置过夜.(2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱,用生理盐水洗脱.流速控制在1ml／1分钟,收集棕色流出液.如体积大于5ml,则以PEG浓缩至5ml.放置25ml小烧杯中,缓慢搅拌.(3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中.(4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml,继续搅拌3?小时.(5) 加0.2M赖氨酸0.25ml,混匀后,置室温2小时.(6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时.(7) 3000rpm离心半小时,弃上清.沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中.(8) 将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存.
3.结果判定
(1) 定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验.然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定其活性.最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择).(2) 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm).酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4 IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62 酶量(mg／ml) IgG量(mg／ml) 酶量 克分子比值＝———————— ÷ ——————— ＝ ——— × 4 40,000 160,000 IgG量 (3) 本法标记步骤比较简单,重复性好.缺点是酶的利用率低,一般只有2～4％的酶与蛋白质结合.
4.试剂及器材
(1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml,0.2M NaH2PO4 51ml,NaCl1.8克,加蒸馏水至200ml.(2) 1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合.(3) 1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合.(4) 0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中.(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理盐水.(6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液.(7) 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG,MW2000).(8) 纯化的特异性抗体或抗Ig抗体.(9) HRP(RZ>3.0).(10) Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm).(11) 搅拌器,分光光度计,离心机.(12) 透析袋,大、小烧杯,试管,吸管等.