PCR扩增得到产物后,重组载体,转入大肠杆菌,菌落培养,先是质粒提取后琼脂糖凝胶电泳,得到下面图谱,

来源：学生作业帮编辑：拍题作业网作业帮分类：生物作业时间：2024/06/12 00:03:58

团长,这个图怎么分啊

PCR扩增得到产物后,重组载体,转入大肠杆菌,菌落培养,先后经过氨苄青霉素筛选（载体上有氨苄抗性基因,大肠中没有）和蓝白班筛选,挑取菌落,质粒提取,琼脂糖凝胶电泳,得到下面图谱,如何分析啊?

你在实习吗?
　　用的是T载体?载体多大?插入的PCR产物多大?marker里每条带多大?尤其最亮那条?
再问：嗯，是pUM-T载体，2702bp。marker用的是1kb Plus DNA Ladder Maker，最亮的理论来说应该是3000bp的，应该是第六条带，但是实验结果中最亮的条带是第七条带，不知道是咋搞的。PCR产物400bp左右。
再答：

最下面是杂带，看来感受态可能不太干净。最上面是基因组DNA，不用理它。中间的条带从大小看像是质粒，可以分为三组：A、B是第一组，分子量最大；1、2、3、4是第二组，分子量居中；a是第三组，分子量最小。仅从电泳图来看，如果a组是自连，1234就可能是阳性；如果1234是自连，AB可能就是阳性。
再问：不过挑取菌落的时候，全部都是白斑菌落啊，有一个是蓝斑菌落在最右边，为什么白斑还会有不同啊？而且蓝白班筛选的整个β-半乳糖苷酶基因都是在载体上，并不是通常的一半在载体上，一半在宿主细胞内。感受态细胞用的是大肠杆菌，大肠杆菌本身旳质粒没条带吗？
再答：　　蓝白筛选只是初选，经常有假阳性。　　感受态细胞一般没有自身的质粒，不过你的电泳图中明显有很多小片段，不知道是什么，正常情况下不应该有，所以我推测感受态不干净。
再问：不过，如果是编码β-半乳糖苷酶的基因全部位于载体上的话，外源基因拆入与否也只会产生两种大小的重组质粒，即自连的和插入外源基因的，为什么还会有三种不同大小啊？
再答：　　PCR产物中可能混有一些长度稍大一些的非特异产物，所以有两种插入片段。不过，这些都是推测。如果T载体连接做成这个样子，一般不是好兆头。你把那几个质粒酶切一下，看看对不对。
再问：就是说如果所有的载体质粒只跑出来有一条相同大小的带就是最好的，无论PCR产物还是连接结果都是比较好的？
再答：　　如果所有质粒大小完全一样反倒无法判断了，最好同时又阴性克隆做对照，这样才好判断。　　T载体常常这样，跑出来乱七八糟的东西。
再问：阴性就是用没有做连接的原始载体质粒跑胶吗？
再答：阴性是指蓝斑。原始质粒太少了，跑电泳太浪费。

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