作业帮菌落PCR做了10次还是不成功···
来源：学生作业帮 编辑：拍题作业网作业帮 分类：生物作业 时间：2024/06/11 14:37:28
菌落PCR做了10次还是不成功···
我是第一次做菌落PCR,但是做了10次都没成功···
用菌是JM83菌,在平板上培养成菌落的,做的时候就挑一点菌进体系中.
我的体系是 mix 混合液（里面包含了dNTP、buffer、Taq酶、Mg离子之类的东西）这是买来可以直接用的,但是不知道里面的含量是多少,不过据说是没问题的.
mix 混合液 10ul
Prime 1 2ul
Prime 2 2ul
ddH20 5ul
模板 1ul
模板是直接挑菌用,没有经过处理的.
然后混合好后直接就拿去P了,但是没成功过.
后来我同学说把菌体处理一下,就是沸水浴加热5min然后高速离心取上清做模板.还是不行.
后来有一次,我不小心把做感受态细胞的水当做ddH2O了,并且退火温度做了一个梯度对比,在大约50到55之间出了一点东西,是750pb的,不是我的目的片段的大小,我的目的片段大概在1300左右.那个水中mg离子浓度相当高,是80mM,里面还有20mM的Ca离子.
所以我就认为是不是mix的mg离子浓度不够,所以今天在体系中加了25mM,2.5ul的Mg离子,而ddH2O就只加了2.5ul.可是出来的结果却是Marker跑得不错,但是10个样中都只有引物···这还是没出结果···现在都不知道该怎么办了···
我是第一次做菌落PCR,但是做了10次都没成功···
用菌是JM83菌,在平板上培养成菌落的,做的时候就挑一点菌进体系中.
我的体系是 mix 混合液（里面包含了dNTP、buffer、Taq酶、Mg离子之类的东西）这是买来可以直接用的,但是不知道里面的含量是多少,不过据说是没问题的.
mix 混合液 10ul
Prime 1 2ul
Prime 2 2ul
ddH20 5ul
模板 1ul
模板是直接挑菌用,没有经过处理的.
然后混合好后直接就拿去P了,但是没成功过.
后来我同学说把菌体处理一下,就是沸水浴加热5min然后高速离心取上清做模板.还是不行.
后来有一次,我不小心把做感受态细胞的水当做ddH2O了,并且退火温度做了一个梯度对比,在大约50到55之间出了一点东西,是750pb的,不是我的目的片段的大小,我的目的片段大概在1300左右.那个水中mg离子浓度相当高,是80mM,里面还有20mM的Ca离子.
所以我就认为是不是mix的mg离子浓度不够,所以今天在体系中加了25mM,2.5ul的Mg离子,而ddH2O就只加了2.5ul.可是出来的结果却是Marker跑得不错,但是10个样中都只有引物···这还是没出结果···现在都不知道该怎么办了···
按你的实验体系来看你的mix是2×的吧,同时你的引物应该是5uM左右的吧?
重复你的实验,但做如下改进：
1,挑菌进500ul的ddH2O,充分混匀,不需煮,取1ul做模板,你之前直接挑菌,模板有可能过多,也会p不出带；（也可以先把克隆挑到1-5ml的LB中摇菌1小时,直接取1ul来做模板）
2,设阴性对照以及阳性对照（用有目的片段的质粒或菌为模板）,如果阳性对照能出来,而你还没p出来,就说明你的菌里没目的片段.
3,你的片段为1.3kb,如果你用的是普通taq的mix,那么你的延伸要设90s或100s才够,退火温度将梯度设在52-60℃.酶离子就别多加了.
此外,检查你的平板是不是太长时间了,抗生素失效?会造成质粒丢失,自然p不出来.
再问： 我们设温度是 95℃ 5min 95℃ 40s 50~56℃ 40s 72℃ 1分30秒 72℃ 5min
再答： 这没问题，没p出来确实奇怪，按我的建议，你再试试。菌应该是很好p的
再问： 我的引物浓度是10uM```不是5uM···浓度是按买来的说明书上配的···100mM稀释到10mM···难道高了么？师兄都说这个浓度是可以的···
再答： 一般引物的终浓度落在0.1-1uM之间比较好，我一般做是在0.5，所以我推测你的是5uM，你的是10uM，按你的体系最终是在1uM，这也没关系，只是稍有浪费，可能会有更多的引物二聚体。 你的实验，引物只要设计没问题，浓度不是关键，你重复了这么多次，我觉得问题还是可能出在模板，也就是你的克隆中到底有没有目的片段。 如果pcr再做不出来，你就干脆提摇菌，提质粒，做双酶切鉴定，看能否切出你的目的片段。如果能，就测序看看，如果不能，那就是阴性。
再问： 用了一个高保真酶，体系不用MIX了，自己配的···最后终于做出来了···%>_
重复你的实验,但做如下改进：
1,挑菌进500ul的ddH2O,充分混匀,不需煮,取1ul做模板,你之前直接挑菌,模板有可能过多,也会p不出带；（也可以先把克隆挑到1-5ml的LB中摇菌1小时,直接取1ul来做模板）
2,设阴性对照以及阳性对照（用有目的片段的质粒或菌为模板）,如果阳性对照能出来,而你还没p出来,就说明你的菌里没目的片段.
3,你的片段为1.3kb,如果你用的是普通taq的mix,那么你的延伸要设90s或100s才够,退火温度将梯度设在52-60℃.酶离子就别多加了.
此外,检查你的平板是不是太长时间了,抗生素失效?会造成质粒丢失,自然p不出来.
再问： 我们设温度是 95℃ 5min 95℃ 40s 50~56℃ 40s 72℃ 1分30秒 72℃ 5min
再答： 这没问题，没p出来确实奇怪，按我的建议，你再试试。菌应该是很好p的
再问： 我的引物浓度是10uM```不是5uM···浓度是按买来的说明书上配的···100mM稀释到10mM···难道高了么？师兄都说这个浓度是可以的···
再答： 一般引物的终浓度落在0.1-1uM之间比较好，我一般做是在0.5，所以我推测你的是5uM，你的是10uM，按你的体系最终是在1uM，这也没关系，只是稍有浪费，可能会有更多的引物二聚体。 你的实验，引物只要设计没问题，浓度不是关键，你重复了这么多次，我觉得问题还是可能出在模板，也就是你的克隆中到底有没有目的片段。 如果pcr再做不出来，你就干脆提摇菌，提质粒，做双酶切鉴定，看能否切出你的目的片段。如果能，就测序看看，如果不能，那就是阴性。
再问： 用了一个高保真酶，体系不用MIX了，自己配的···最后终于做出来了···%>_
我们现在准备做菌落pcr,可以问一下你pcr时需不需要加石蜡油这种东西?还是其他物质啊.
革兰氏阳性菌PCR革兰氏阳性菌如何做菌落PCR?煮20 min后,还是不能P出目的条带.
菌株菌粉可以直接做菌落PCR么?
菌落PCR有关问题?我们做了转化实验,将转化后的菌涂在含Kan抗性的平板上,为什么挑取能生长的菌落做PCR没有目的条带?
在做菌落总数测定时所有稀释度的平板都没菌落,都做了两次了还是不敢相信自己的眼睛啊?
在做菌落总数测定时所有稀释度的平板都没菌落,都做了好几次了还是不敢相信自己的眼睛啊?
什么是菌落pcr假阳性
用革兰氏阳性菌做菌落PCR时,怎样处理菌体模板?
转化后挑取含有目的片段的单菌落摇菌扩增以后划盘子,几天后挑取部分菌落做PCR无带,不知是何原因?
大肠杆菌转化后做菌落pcr一直p不出带是怎么回事?麻烦高手指教下pcr体系及反应时的程序,目的基因大概1000bp
做菌落检验的时候,1:10平皿没有菌落,1:100平皿却出现菌落是什么原因?而且菌落大多实在平皿表面边缘处
不成功